破骨細(xì)胞骨吸收檢測(cè)操作流程

骨切片Bone Slice

產(chǎn)品描述：

開(kāi)始骨吸收實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基重懸骨切片，成熟或早熟的破骨細(xì)胞，無(wú)論是由外周血單核細(xì)胞（PBMC）或共培養(yǎng)產(chǎn)生的，都可以將細(xì)胞分散覆蓋于骨切片上。根據(jù)破骨細(xì)胞的成熟形態(tài)和影響因素，凹點(diǎn)會(huì)在3-14天出現(xiàn)。破骨細(xì)胞數(shù)量可通過(guò)Tracp 活性實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察，吸收凹點(diǎn)和溝可通過(guò)甲苯藍(lán)染色觀察（如圖2.）。

來(lái)源：骨切片由牛股骨的皮質(zhì)部分制成，適合96孔板，直徑6mm。

厚度：1）0.2mm（適用于免疫熒光，共聚焦實(shí)驗(yàn)）。
        2）0.4mm（適用于下游分析）
儲(chǔ)存：置于4°C下96%乙醇中。
應(yīng)用：用于骨吸收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，通過(guò)破骨細(xì)胞的骨吸收形成的吸收坑，可以用來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞的骨吸收情況，適合96孔板。

操作流程：

骨吸收實(shí)驗(yàn)

簡(jiǎn)介：

該方法提供一種易于檢測(cè)的定量方案，用于體外測(cè)定破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。破骨細(xì)胞接種于骨切片上，吸收坑的形成可以通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行定量。

實(shí)驗(yàn)材料和試劑：

1）  破骨細(xì)胞

2）  骨切片

3）  異丙醇

4）  甲苯胺藍(lán)（Sigma cat#198161）

5）  超純水

6）  96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Greiner , Cat#650185）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

1.       骨形態(tài)測(cè)量系統(tǒng)

2.       超聲波清洗器

操作流程：

1.       破骨細(xì)胞接種于（250000 細(xì)胞/孔）含和不含顱骨成骨細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（提前孔內(nèi)放置骨切片）。

2.       細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至少14天。

3.       此后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，在250ul 70%異丙醇中，用超聲波高功率處理至少15分鐘，使細(xì)胞從骨切片脫落。

注意：250ul 70%異丙醇處理使細(xì)胞更容易從骨切片脫落。

4.       加入100ul 甲苯胺藍(lán)溶液（1%溶解于水），室溫染色2分鐘。

5.       用250ul 超純水沖洗骨切片至少5次，以洗掉切片上的殘留物。

6.       吸收坑被染成深藍(lán)色（圖1），吸收坑面積可以通過(guò)骨測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行量化或者吸收坑可通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

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