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Human sCD141 ELISA Kit
更新時(shí)間：2015-03-16
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產(chǎn)品名稱：Human sCD141 ELISA Kit
中文名稱：人cd141 ELISA 檢測(cè)試劑盒
生產(chǎn)廠家：法國(guó)Diaclone
貨號(hào)：950.720.096
Human sCD141 ELISA Kit
(中文說(shuō)明書供參考，請(qǐng)以到貨的英文說(shuō)明書為準(zhǔn))
用途：人sCD141 ELISA試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清，血漿，緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的sCD141,試劑盒可用于檢測(cè)天然和重組的人sCD141,此試劑盒只用于科研，不能用于診斷。
檢測(cè)原理：
sCD141試劑盒應(yīng)用的是夾心法固相酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。sCD141特異單克隆抗體被包被于微孔板上，已知sCD141濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度的樣品可在此反應(yīng)孔中進(jìn)行檢測(cè)。先將sCD141抗原和生物素標(biāo)記sCD141特異單克隆抗體同時(shí)孵育。洗滌后加入親和素過(guò)氧化物酶，孵育后洗去未結(jié)合的酶。其后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顏色的深淺與樣品中sCD141的濃度成一定的比例關(guān)系。
試劑盒組成及配制：
試劑（2-8℃保存） | 1x96孔的配置 產(chǎn)品編號(hào)：#873.020.096 | 配制 |
96T微孔板 | 1 | 即用型(已包被) |
塑料板蓋 | 2 | |
標(biāo)準(zhǔn)品：20ng/ml | 2瓶 | 按瓶上的說(shuō)明稀釋（見(jiàn)試劑制備，） |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶（25ml） | 10X濃度，用純水稀釋 |
對(duì)照 | 2 | 按瓶上的說(shuō)明稀釋（見(jiàn)試劑制備，） |
生物素標(biāo)記cd141抗體 | 1瓶(0.4ml) | 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋（見(jiàn)試劑制備） |
生物素標(biāo)記抗體稀釋液 | 1瓶(7ml) | 即用型 |
親和素-HRP | 2支(5ul) | 0.5ml HRP稀釋液預(yù)稀釋（見(jiàn)試劑制備，） |
HRP稀釋液 | 1瓶(23ml) | 即用型 |
洗滌緩沖液 | 1瓶(10ml) | 200x，蒸餾水稀釋（見(jiàn)試劑制備） |
TMB | 1瓶(11ml) | 即用型 |
H2SO4終止液 | 1瓶(11ml) | 即用型 |
自備材料：
蒸餾水；加樣器：10ul, 50ul, 100ul, 200ul, 1000ul; 漩渦振蕩器和磁力攪拌器
保存條件：
試劑盒保存于2-8度，
樣品收集，處理和保存：
- 細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000xg離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
- 血清——操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000xg離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
- EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測(cè)。1000Xg離心30分鐘去除顆粒。
- 如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免反復(fù)凍融。
如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。
注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍
實(shí)驗(yàn)方案：
用前所有試劑置于常溫
標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照 pg/ml | 樣品 | |||||||||||
A | 20 | 20 | ||||||||||
B | 10 | 10 | ||||||||||
C | 5 | 5 | ||||||||||
D | 2.5 | 2.5 | ||||||||||
E | 1.25 | 1.25 | ||||||||||
F | 0.625 | 0.625 | ||||||||||
G | 空白 | 空白 | ||||||||||
H | 對(duì)照 | 對(duì)照 | ||||||||||
試劑準(zhǔn)備：
- 洗滌緩沖液（200x）的稀釋：蒸餾水200倍稀釋成1X的工作液。
- 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備：用前加入225ml純水，2-8度可保存一周以上。
- 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：按標(biāo)準(zhǔn)品瓶上的說(shuō)明，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，稀釋后濃度為20ng/ml。溫柔上下顛倒混勻。直接在檢測(cè)板上對(duì)校準(zhǔn)品做系列稀釋，濃度范圍：20-0.625ng/ml。每次重新做實(shí)驗(yàn)，都需要重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取200ul重懸后的標(biāo)準(zhǔn)品到A1, A2孔（1000pg/ml），取100ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到B1, B2, C1, C2, D1,D2, E1,E2, F1, F2孔。從A1, A2孔吸取100ul到B1, B2孔，用加樣器反復(fù)吸排使其混合。小心不要擦到孔的內(nèi)表面。同樣從B1, B2孔吸取100ul到C1,C2；再?gòu)腃1,C2到D1,D2等，從zui后的兩個(gè)孔（F1, F2）中吸去100ul不要。這樣從A1,A2到F1,F2，cd141標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的濃度為20ng/ml到0.625ng/ml。也可在試管中進(jìn)行此稀釋，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品直接加入反應(yīng)孔中。
- 樣品制備：在檢測(cè)前，人血清或血漿樣本需要用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1:2稀釋。
- 生物素標(biāo)記cd141抗體的制備：
生物素標(biāo)記抗cd141的稀釋：每次實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的孔數(shù)，以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋。稀釋量見(jiàn)下表。
反應(yīng)孔的數(shù)量 | 生物素標(biāo)記抗體（ul） | 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ul） |
16 | 40 | 1060 |
24 | 60 | 1590 |
32 | 80 | 2120 |
48 | 120 | 3180 |
96 | 240 | 6360 |
- 親和素-HRP的稀釋：5ul 親和素-HRP加入0.5ml HRP稀釋液, 每次實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，不要保存此稀釋后液體。根據(jù)反應(yīng)孔的數(shù)量進(jìn)一步稀釋，見(jiàn)下表。
反應(yīng)孔的數(shù)量 | 親和素-HRP(ul) | 親和素-HRP稀釋液(ml) |
16 | 30 | 2 |
24 | 45 | 3 |
32 | 60 | 4 |
48 | 75 | 5 |
96 | 150 | 10 |
檢測(cè)程序
使用前，將所有試劑充分混合，不要使液體產(chǎn)生泡沫。根據(jù)樣品數(shù)量加上空白，標(biāo)準(zhǔn)品決定所需的板條，每個(gè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)品，空白和質(zhì)控都應(yīng)做雙份。
詳細(xì)步驟 | |
1 | 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
2 | 按實(shí)驗(yàn)方案在對(duì)應(yīng)孔加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣本,標(biāo)準(zhǔn)品，樣本及空白孔,對(duì)照均做復(fù)孔。 |
3 | 加入50ul生物標(biāo)記的cd141抗體到各孔 |
4 | 用塑料膜封板，室溫（18-25.℃）孵育1小時(shí)。 |
5 | 去掉封板膜，按以下程序洗板：
|
6 | 加入100ul親和素-HRP溶液到各孔 |
7 | 用封板膜，封板，室溫（18-25.℃）孵育30min |
8 | 重復(fù)步驟5 |
9 | 加入100ul即用型TMB底物溶液至各孔 |
10 | 室溫避光孵育10-15min，用鋁箔包住反應(yīng)板， 避免光照。 |
11 | 加入100ul H2SO4到各孔，終止反應(yīng)。 |
在分光光度計(jì)中讀取結(jié)果。450nm作為初始波長(zhǎng)，620nm作為參考波長(zhǎng)。 | |
注：制備的生物素標(biāo)記抗cd141及親和素-HRP應(yīng)立即使用。
結(jié)果分析
以吸光度為Y軸，相應(yīng)的cd141標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的cd141含量可根據(jù)其O.D.值由標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出來(lái)。
局限
不要在超出標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍，推測(cè)樣本的檢測(cè)值，超出檢測(cè)范圍的樣本值不呈線性。高濃度的樣品請(qǐng)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或自備的樣品稀釋液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍，然后樣品實(shí)際測(cè)值再乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
不同藥物會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。細(xì)菌或真菌及實(shí)驗(yàn)室交叉污染，都可導(dǎo)致不規(guī)律的檢測(cè)數(shù)據(jù)。
不正確或不充分的洗滌都可以導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。
靈敏度：
zui小的人cd141檢測(cè)濃度小于0.31ng/ml。
精密度：
批內(nèi)：
批間：
檢測(cè)過(guò)程：（總時(shí)長(zhǎng)1h45min）
加100ul樣品或稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ占?0ul生物素標(biāo)記的cd141抗體
↓
室溫孵育1h
↓
洗滌三次
↓
加入100ul親和素-HRP
↓
室溫孵育30min
↓
洗滌三次
↓
加入100ul TMB，避光顯色12-15min
↓
加入100ul H2SO4
↓
|
450nm讀取吸光度
